Wir produzieren Peptide
effizient und planbar
in E. coli

NUMAFERM’s platform technology

Verfügbare Biotechnologien werden vielfach für die Produktion von Enzymen (und anderer Proteine) eingesetzt. Chargengrößen im Tonnenmaßstab und niedrige Produktionskosten von 10-20 €/kg (van Beilen et al., Current opinion of biotechnology, 2002) sind gängig. Hinsichtlich der rekombinanten Produktion von Peptiden besitzen aktuelle Verfahren jedoch drei wesentliche Limitierungen: 1. omnipräsente Proteasen führen zum Abbau von Peptiden (Abbildung 1), 2. hydrophobe Interaktionen führen zur Aggregation von Peptiden und somit zu einem komplizierten Downstreaming, und 3. toxische Effekte von Peptiden gegenüber den Produktionswirt, insbesondere bei antimikrobiellen Peptiden. Die Technologie von NUMAFERM bewältigt diese Herausforderungen und dient als verlässliche und kosteneffiziente, rekombinante Produktionsplattform. Wie ist uns dieser Erfolg gelungen? Wie haben biobasierte Prozessinnovationen entwickelt, die uns eine planbare, effektive und kosteneffiziente Peptidproduktion erlauben.

Sekretionsansatz

Wir haben die erste Sekretionstechnologie für gram-negative Bakterien entwickelt; als Arbeitspferd dienen uns dabei gewöhnliche E. coli Stämme. Zusätzlich haben wir einen trifunktionalen Fusionspartner mit faszinierenden Eigenschaften entwickelt der die rekombinante Produktion von Peptiden erlaubt – den NUMAtag. Wie funktioniert dies? Im ersten Schritt wird das gewünschte Peptide mit dem NUMAtag gekoppelt. Der NUMAtag wird vom sogenannten Typ 1 Sekretionssystem (T1SS) erkannt, welche den sofortigen Transport des Fusionspeptides über die gram-negative Zellwand in den proteasefreien Kulturüberstand von E. coli katalysiert (1. Tag-Funktionalität: TRANSPORT).

Dieser Transport über zwei phospholipid-Membranen nennt sich Sekretion (Abbildung 2). Durch diesen Schritt werden Peptide gegen die Zerstörung durch Proteasen im Zellinnern geschützt. Typ 1 Sekretionssysteme bestehen aus drei verschiedenen Membranproteinen, welche zusammen eine Nanomaschinerie bilden.

Nach dem Transport verbleibt der NUMAtag zunächst am Peptid gekoppelt um die Löslichkeit zu erhöhen (Tag-Funktionalität 2: SOLUBILITY).
Außerdem verhindert der NUMAtag sterisch die Interaktion des Peptidds mit dem Produktionswirt und senkt somit zytotoxische Effekte. Dies ist insbesondere bei der Herstellung antimikrobieller Peptide wichtig (Tag-Funktionlität 3: PROTECTION). In Summe erlauben diese Funktionalitäten hohe Produktionstiter (verringerte Toxizität) von intakten Peptiden (keine proteolytische Zerstörung) und unterstützen im Downstreaming (gesteigerte Löslichkeit).
Ganz nebenbei ist die initiale Reinheit der Funsionspeptide sehr hoch (siehe Bande a in Abbildung 2), wodurch ein kosteneffizientes Downstreaming ermöglicht wird. Für den Einsatz in vielen technischen Applikationen kann der NUMAtag am Peptid verbleiben, da dieser die Funktionalität des Peptids gar nicht oder nur gering einschränkt. Bei Bedarf kann der NUMAtag aber auch effektiv abgespalten werden um 100% sequenzidentische Peptide herzustellen. Dies ist insbesondere für pharmazeutische Anwendungen wichtig.

In dieser Weise löst die biotechnologische Produktionsplattform von NUMAFERM die Limitierungen bisheriger Verfahren und ermöglicht die kosteneffiziente Herstellung rekombinanter Peptide.

Zusätzlich haben wir einen weiteren smarten Ansatz gefunden um Peptide zu produzieren – wir nennen ihn den NUMAswitch. Er erlaubt uns die Produktion „löslicher Inclusion Bodies“ und begegnet erfolgreich den wesentlichen Limitierungen klassischer Inclusion-Body-Tags.

Molecular Switch 

In einem ersten Schritt wird das gewünschte Peptid mit dem NUMAswitch fusioniert. Dieser bifunktionale Tag überträgt zwei Funktionalitäten auf das Peptid.
Zunächst bringt er Peptide dazu, ungelöste Aggregate innerhalb der Zelle zu bilden – die sogenannten Inclusion Bodies (Funktionalität 1: INCLUSIONBODY, IBtag; OFF-Zustand des Swichtes). Diese Aggregate sind gegenüber Protease resistent und die Fusionskonstrukte werden nicht abgebaut. Expressionslevel von Peptiden, die mit dem NUMAswitch fusioniert sind, sind sehr hoch und standardisierte Hochzelldichtefermantation sind bei NUMAFERM etabliert. Normalerweise gibt es eine wesentliche Einschränkung bei herkömmlichen IBtags: die Umwandlung von Aggregaten zu löslichen Fusionskonstrukten – die sogenannte Renaturierung. Dies liegt in der Natur der Sache denn das originäre Ziel von IBtags ist die Bildung von Aggregaten und nicht von gelösten Fusionskonstrukten. Jedoch sind gelöste Fusionskonstrukte in vielen Fällen notwendig.

Denn nur dieser gelöste Zustand erlaubt die Gewinnung funktionaler Fusionskonstrukte oder eine Abtrennung des NUMAswitches mit sequenzspezifischen Proteasen. Bisher ist dies ein großes Problem denn entweder funktioniert die Renaturierung nicht oder mit einer sehr geringen Effizienz (≤ 25% Ausbeute). Der NUMAswitch bietet hierfür die Lösung denn mit ihm können Fusionskonstrukte effizient renaturiert werden (Funktionalität 2: RENATURATION). Nachdem die Inclusion Bodies, bestehend dem Fusionskonstrukt aus Zielpeptid und dem NUMAswitch, gelöst werden (in chaotropischen Salzen, Detergenzien, organischen Lösungsmittel, Basen usw.) werden sie mit NUMAFERM’s proprietärem Puffer inkubiert. Das Konstrukt wird dann sehr effizient renaturiert (fast 100% Ausbeute) und mit Konzentrationen im Bereich von mg/mL (On-State of the Switch, siehe Abbildung 3, Schritt 3). Dies erlaubt die Gewinnung funkionaler, gelöster Fusionskonstrukte oder die Anwendung sequenzspezifischer Proteasen. Diese wären im denaturierten Zustand unbrauchbar.

In Summe bietet der NUMAswitch die Vorteile von IBtags (Schutz des Peptids vor Proteolyse, starke Expression, gute initiale Reinheit) und löst bestehende Limierungen (ineffiziente Renaturierung). Somit dient auch diese Technologie als verlässliche, kosteneffiziente, rekombinante Produktionsplattform für reine Peptide oder für funktionale Fusionskonstrukte.

Vorteile unserer Technologie

Peptide werden durch unsere Technologie günstiger. Besondere bei größeren Produktionsmengen und/oder längerer Sequenzen bietet unsere Technologie signifikante Vorteile hinsichtlich der Produktionskosten.

Wir können gegenüber der chemischen Synthese den CO2-Austoß deutlich reduzieren. Die Produktions eines Kilogramms Peptid verlangt den Einsatz von mehr als 25 Tonnen Roh-, Hilfs- und Betriebsstoffen, von denen einige sehr toxisch sind. Unser Bioprozess hingegen benötigt nur einige hunder Kilogramm nicht unbedenklicher Rohstoffe.

Wir können Peptide jeglicher Länge innerhalb einer Woche produzieren. In der chemischen Synthese kann dieser Prozess, abhängig von der Länge des Peptids, bis zu mehreren Monaten dauern.

Wir können problemlos lange Peptide, sogenannte Polypeptide, herstellen. Die begrenzte Peptidlänge ist eine wesentliche Limitierung der chemischen Synthese. Mit jeder zusätzlichen Aminosäure wird der Herstellung überproportional teurer.

FAQ

Was ist die maximale Peptidlänge die hergestellt werden kann?

Es gibt buchstäblich keine Limitierung hinsichtlich der Peptidlänge. Wir können sowohl Oligopeptide als auch Polypeptide herstellen. Peptide sind u.A. über eine typische Länge von 2 bis 100 Aminosäuren definiert. Für unsere Technologie gilt diese Grenze jedoch nicht und es können sogar Enzyme und andere Proteine hergestellt werden.

Wie kann ich Peptide bei NUMAFERM bestellen?

Rufen Sie uns einfach unter +49 211 97532901 an oder schreiben Sie uns eine E-Mail an info@numaferm.com. Auch unser Kontaktformular können Sie nutzen. Wir bewerten dann die von Ihnen angefragte Sequenz und geben Ihnen eine schnelle Rückmeldung darüber, ob diese mittels unserer Technologie darstellbar wäre.

Welche Reinheitsgrade bieten wir an?

All unsere Produkte besitzen eine initiale Reinheit von >85%  und wir können ohne weiteres auch >99% Reinheit anbieten.

Produziert NUMAFERM auch GMP Material?

Wir realisisieren die Produktion von GMP Material mit Partnern. Unsere Technologie ist grundsätzlich für die GMP Produktion geeignet.

Können c-terminal amidierte Peptide hergestellt werden.

Nein, dies ist aktuell nicht möglich.

Besitzen die Produkte von NUMAFERM Glykolisierungen?

Nein, unsere Produkte sind komplett frei von Glykolisierungen.